近年来，在体外大规模培养肿瘤细胞来模拟体内病理环境的技术已有了极大进展。如果将培养的肿瘤细胞加入圆底的微孔中，这些富集的细胞就会形成离散的球体。这些离散的球体同时包含了暴露在表面的和深埋在内部的细胞，增殖的和非增殖的细胞，外面的富氧层和内部的缺氧中心。基于上述特点，与传统的二维细胞培养方法相比，这种球体可以更好的模拟肿瘤的行为特点。而这种三维肿瘤细胞球体模型已经被成功的应用于肿瘤治疗方法的筛选中。而建立更成熟健全的球体实验目前还面临一些挑战：

• 定位每个微孔中的球体使其在单视野中成像

• 优化染色处理过程在保证染料渗透性的同时，避免干扰球体的定位

• 获得整个3D结构的清晰图像，尽量减少成像平面外背景信号和散焦的影响

• 可以迅速的分析图像得到有意义的结果并同时绘制出图表

一、肿瘤球的形成及处理

我们用以下方法构建HCT116，DU145，HepG2肿瘤细胞系的微球体。首先，在37度和5%CO2条件下在培养瓶中培养肿瘤细胞，以每孔1000-1500细胞的浓度将培养的细胞种于U型孔底的96或384孔的黑色细胞板中（corning 4520 和 3830），培养基为加入FBS的完全培养基。每孔中的单球体在24小时之内就会成形。在37度和5% CO2培养条件下，细胞球会继续生长，2-4天后即可用于实验。如果细胞球培养时间过长，其过大的体积会影响染料的穿透性以及球体中心的成像效果。说明书中注释了如何用细胞球检验依托泊苷，紫杉醇和丝裂霉素C的抗肿瘤效果。首先，将待测化合物以10x浓度加入到含有球体的孔板中孵育1-4天，孵育时间的长短取决于实验者的想要研究的机制。短期培养适合于凋亡机制研究，而长期培养适合于多因素细胞毒性研究。如果药物处理时间超过两天，需要每两天以1x浓度更新药物。

二、细胞球的染色及成像

示例中展示的是利用HCT116细胞小球评估球体形态变化及细胞凋亡率。在加入药物处理后，将染料混合以4-6倍浓度直接加入板孔的培养基中。染色过程中不能清洗以防影响小球状态。运用ImageXpress Micro 高内涵成像分析系统，在10x或者20x物镜下对小球进行拍摄。为了分析整个球体3D结构的细胞反应，系统会采集不同层面的图像并创建一个图像“集合包”。这个集合包中的图像可以合并或用数学算法投射到一张2D图像，这张图中的每个象素点保留了对比度最强的那一层的图像数据，最终形成3D图像的2D投射图

三、ImageXpressMicro Confocal共聚焦模式成像使图像更锐利，分析更准确

相对于宽场成像，共聚焦可以对球体进行薄层成像，这大大降低了来自于成像平面之外的背景荧光信号的干扰。同时，共聚焦成像也可以在3D水平上更好的分辨亚细胞结构以及肿瘤细胞的聚集和堆叠。运用共聚焦成像技术还可以完成更精确细胞分割。在肿瘤小球的重复试验中，与宽场成像相比，共聚焦成像统计到的细胞核数要多20%。

四、粒体膜电位评估

在上述的细胞凋亡筛选过程中，我们还可以在混合染料中加入MitoTracker Orange来评估线粒体膜电位。这一方法可以帮助我们研究通过影响线粒体代谢途径来抑制肿瘤生长的药物。下面阐述了我们针对抗霉素A，一种线粒体膜电位强力干扰剂，的研究。在经过4个小时的处理后，基于MitoTrackerOrange的荧光强度我们可以观察肿瘤微球体细胞中的线粒体状态。结果显示小球中心部位的红色荧光很弱，可能是因为MitoTracker并没有完全的渗透到小球中心，也可能是位于中心的细胞线粒体已受到损害。

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